一、介紹
類器官培養(yǎng)技術(shù)是一種利用干細(xì)胞或腫瘤組織在體外三維（3D）微環(huán)境下進(jìn)行自組織培養(yǎng)，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)和功能的微型器官的技術(shù)。這些類器官能夠高度模擬真實(shí)器官的特征，包括組織學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能。培養(yǎng)方法主要包括浸沒式基質(zhì)膠培養(yǎng)、氣液界面培養(yǎng)和生物反應(yīng)器培養(yǎng)等。
1.1．儀器設(shè)備：
CO?培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、臺式離心機(jī)、水浴鍋/搖床、-80℃冰箱、冰盒。
眼科剪/鑷、移液器、15 mL離心管、100 μm濾篩、24孔低吸附培養(yǎng)板。
2.2．試劑耗材
培養(yǎng)基：選擇組織特異性培養(yǎng)基。
基質(zhì)膠：低因子、無酚紅型，需4℃過夜融化，操作全程冰上進(jìn)行[1]。
消化液：膠原酶（I/IV型）、胰蛋白酶。
其他：組織保存液、類器官凍存液（含DMSO）。
2.1 樣本處理
取材與保存：離體組織立即浸入4℃預(yù)冷組織保存液（含雙抗），運(yùn)輸時(shí)間≤72小時(shí)。
清洗剪碎：PBS（含雙抗）沖洗3次，去除血污；立體顯微鏡下剔除脂肪/壞死組織剪成1-3 mm3碎片，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管。
組織消化：配制膠原酶+胰蛋白酶混合液，37℃預(yù)熱。 按組織體積1:4加入消化液[2]，37℃搖床（120 rpm）消化20-60分鐘；每5分鐘取樣鏡檢，至細(xì)胞團(tuán)（5-50個(gè)細(xì)胞）出現(xiàn)時(shí)終止。
終止與過濾：加入3倍體積終止緩沖液（如含FBS的培養(yǎng)基）；100 μm濾篩過濾，離心（300g，5分鐘）棄上清。
2.2 培養(yǎng)基配制
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：選擇適合細(xì)胞生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，需選擇添加以下成分：
生長因子：EGF（促進(jìn)增殖）[3]、Wnt3a（維持干細(xì)胞特性）[4]、Noggin（抑制分化）[5]、R-spondin1（增強(qiáng)Wnt信號）[6]。
小分子化合物：如Y-27632（ROCK抑制劑，減少細(xì)胞凋亡）[7]。
pH與滲透壓：嚴(yán)格校準(zhǔn)至7.4，避免影響細(xì)胞代謝。
2.3 基質(zhì)膠接種
細(xì)胞重懸：沉淀用預(yù)冷PBS清洗1次，按1×105[8]個(gè)細(xì)胞/50 μL基質(zhì)膠比例重懸。
點(diǎn)板固化：24孔板每孔點(diǎn)膠50 μL（避免氣泡）；37℃培養(yǎng)箱靜置30分鐘，待膠凝固后加入500 μL培養(yǎng)基。
2.4 培養(yǎng)與觀察
培養(yǎng)條件：37℃、5% CO?，每2-3天換液（吸棄舊液，沿孔壁緩慢加入新培養(yǎng)基）。
形態(tài)監(jiān)測：初期（3-5天）：類器官呈囊狀或?qū)嵭那蝮w；成熟期（10-14天）：直徑200-500 μm[8]，結(jié)構(gòu)致密。
3.1 收集與洗滌：
吸棄培養(yǎng)基，加入4℃預(yù)冷緩沖液（如PBS），吹打分散膠體。300g離心5分鐘，棄上清及基質(zhì)膠層；若分層不清，重復(fù)冷化步驟或棄上1/3懸液。
3.2 消化與分選：
加入消化液（37℃，2-3分鐘），吹打成2-10細(xì)胞團(tuán)；加入5倍體積緩沖液終止，離心后按1:2-1:3比例接種。
4.1 凍存：
類器官直徑100-200 μm時(shí)（指數(shù)生長期）。收集類器官，加入凍存液（90% FBS+10% DMSO）；梯度降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮）。
4.2 復(fù)蘇
快速解凍：37℃水浴1-2分鐘，PBS清洗2次；
重懸培養(yǎng)：按原代步驟接種，初期培養(yǎng)基添加ROCK抑制劑。
參考文獻(xiàn)
[1]. Else Driehuis, Kai Kretzschmar and Hans Clevers . Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. NATURE PROTOCOLS, 2020 Oct;15(10):3380-3409.
[2]. Boehnke K , Iversen P W , Schumacher D ,et al.Assay Establishment and Validation of a High-Throughput Screening Platform for Three-Dimensional Patient-Derived Colon Cancer Organoid Cultures[J].Journal of Biomolecular Screening, 2016:931-941.DOI:10.1177/1087057116650965.
[3]. 洪倫.生長因子誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在人結(jié)腸癌細(xì)胞中的研究[D].中南大學(xué),2011.DOI:10.7666/d.y1914894.
[4]. 丁界先,張津,陳永剛,王興文,王栓科.Wnt信號通路與腫瘤發(fā)生的研究進(jìn)展[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,2019,33(1):73-77
[5]. 劉卓健,馬軍,杜鳴,等.食管鱗癌類器官培養(yǎng)體系的構(gòu)建[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2022(003):031.DOI:10.3969/j.issn.1006-5709.2022.03.012.
[6]. 伏曉,仇毓東.一種結(jié)腸癌類器官的培養(yǎng)基及其應(yīng)用:CN202111156653.5[P].CN113846061A[2025-03-04].
[7]. Li H, Zhang C, Hu Y, et al. A reversible shearing DNA probe for visualizing mechanically strong receptors in living cells. Nat Cell Bio. 2021 Jun;23(6):642-651.
[8]. Driehuis E , Kretzschmar K , Clevers H .Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications (vol 63, pg 891, 2020)[J].Nature protocols erecipes for researchers, 2021(12):16.
掃一掃關(guān)注公眾號